荆有麟回忆，二人失和后，还常在北大教员休息室见面，一接触便起争执。可一旦有人攻击周作人，鲁迅便用给中笔名代弟弟应战。成仿吾和鲁迅论战时，周作人也在其文章中为鲁迅帮腔。“三·一八惨案”发生后，鲁迅被列入北洋政府的缉捕名单，周作人知道后，马上托人通知鲁迅。
周作人的《五十自寿诗》发表后，友人们纷纷唱和，引发一场风波。鲁迅却能理解二弟，他在给杨霁云的信中说：“周作人之诗，其实是还藏些对于现状的不平的，但太隐晦，已为一般读者所不憭……”
1936年10月19日清晨，鲁迅逝世。第二日，周作人恰好有一堂《六朝散文》课，他没有请假，而是挟着一本《颜氏家训》缓缓走进教室。在长达一个小时的时间里，周作人始终在讲颜之推的《兄弟》篇，只字未提其他事情。第一堂课下课前几分钟，周挥一挥袖子，掸了掸粉笔灰说：“对不起，下一堂课我不讲了，我要到鲁迅的老太太那里去。”这个时候，大家发现周的脸色非常难看。柳存仁回忆：“他并没有哭，也没有流泪，可是眼圈有点红热，脸上青白的一层面色，好像化上了一块硬铅似的。这一点钟的时间，真是一分钟一秒钟的慢慢的捱过，没有一个上课的人不是望着他的脸，安静地听讲的。这个时候容易叫你想起魏晋之间的阮籍丧母的故事。”
解放后，周作人写了《鲁迅的故家》、《鲁迅小说里的人物》等作品，在谈及鲁迅时，也会称“家兄”。陈迩冬回忆，他在周作人屋中见到过鲁迅拓的汉碑，一次，周送他出门时，指着外院的丁香树说：“这是家兄种的。”
1956年，到北京出席鲁迅逝世20周年纪念活动的曹聚仁到八道湾拜访了周作人。之后，曹在《与周启明先生书》中写道：“我们那天又谈到了鲁迅的作品，鲁迅自己推荐了《孔乙已》，因为那一篇小说写得从容不迫”，“我那天说到了自己的爱好，我是最喜欢《在酒楼上》的”，“你也同意我的说法，你说，这是最富鲁迅气氛的小说”。
1958年，周作人在给曹聚仁的信中，谈及上海鲁迅墓前的塑像说：“死后随人摆布，说是纪念其实有些实是戏弄，我从照片看见上海坟头所设塑像，那实在可以真是最大的侮弄，高坐在椅上的人岂非是头戴纸冠之形象乎？假使陈西滢辈画这样一张相，作为讽刺，也很适当了。”
1957年，周作人的女儿静子在西北大学简报发表《回忆我的伯父鲁迅先生》一文。1961年10月，周作人代静子写纪念鲁迅的文章（见张铁荣、张菊香合编《周作人年谱》）。有研究者认为，1957年周静子的《回忆我的伯父鲁迅先生》行文风格完全是周作人式的，周作人也将此文收入其《鲁迅的青年时代》一书中，因此认为，《回忆我的伯父鲁迅先生》也是周作人为静子捉刀，只是周的日记并未记载。
徐淦回忆，他在与周作人日常闲谈中常提到鲁迅，“知堂很很坦率，从他的口吻中，我听出他对杰出的兄长之爱和敬，始终如一，像两人儿时、少时、青壮年、中年时的莫逆有增无减”。羽太信子一次给徐送茶时，也提到鲁迅，周作人当时翻译信子的话说：“内人告诉足下，自从足下来后，院子里的左邻右舍，都对她说，她们觉得又像过去大先生住在这里的时候，看到通宵在灯下干夜活的情形了，她们对大先生都是很敬爱、挺怀念的。”
1966年7月2日，周作人开始阅读鲁迅的杂文。周氏兄弟在离世之际，都是阅读对方的文章。
周作人不仅与长兄鲁迅失和，与三弟周建人的关系亦不睦。
据周海婴记载，羽太信子怀孕后，其妹妹芳子从日本到绍兴照顾信子。信子得到芳子无微不至的照顾后，渐渐离不开芳子了。为了把芳子长久留在身边，她便准备撮合芳子和小叔周建人。
当时周建人青梅竹马的表妹因病去世，他十分悲痛。信子便乘机灌醉了周建人，将芳子推进周建人的房间。鲁迅谈及三弟的婚姻时，说是“逼迫加诈骗成局”。
周建人与芳子婚后，信子更加肆无忌惮地使唤二人。夜深了，她不让芳子回房照顾自己的孩子；她经常使唤周建人，动作稍慢就训斥：“慢得像虫爬！”“木乎乎，木手木脚的中国人！”
据俞芳记载，在绍兴时，周建人与芳子关系尚好。周家迁到北京后，芳子看到姐姐大肆挥霍，十分羡慕，对信子言听计从，效仿信子，贪图享乐，常埋怨丈夫无能，不会赚钱。一次，周作人夫妇、芳子带着孩子去游玩，周建人准备同往，没想到，他走到车子旁边时，芳子一脸不屑地说：“你也去吗？”周建人看着妻子冰冷的表情，十分难受。
周建人到上海后，希望妻子和孩子也一同到上海居住。但信子不让妹妹离开，芳子也不愿离开，反而经常写信向周建人要钱。后来，周建人积劳成疾，患了飞机和，芳子仍拒绝到上海照顾丈夫。五年后，心灰意冷的周建人与王蕴如结合。
鲁迅去世的1936年冬天，鲁老太甜八十寿辰，周建人、王蕴如到北京为母亲祝寿。结果，信子、芳子大闹寿宴，周建人与芳子的长子周丰二更是手持军刀从屋内冲出，要砍周建人，被亲友拦下。此后，周丰二打电话到日本领事馆，要求他们扣留周建人，将其“法办”。周、王二人无奈，只能提前回到上海。时候，鲁老太甜伤心地对俞芳说：“如果大先生还在，八道湾不敢如此嚣张……”
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