1925年10月，蒋介石率国民革命军第一军等进行第二次东征。当时，周恩来担任第一军政治部主任兼第一军第一师党代表和东征军总政治部主任，黄埔军校教官和毕业学生，担任第一军各级指挥官和党代表。经过激战，东征军攻占陈炯明老巢惠州，其他残余部队也很快被肃清，广东革命根据地得到巩固。
蒋介石羽翼渐丰以后，开始露出他反动的真面目。1926年3月16日，蒋介石指使孙文主义学会分子欧阳格，以黄埔军校驻省办事处名义，传令海军局代理局长、中山舰舰长李之龙（共产党员），调中山舰到黄埔候用。当中山舰开到黄埔后，蒋介石派系随即散布谣言，诬陷“中山舰擅入黄埔，是共产党阴谋暴动”。3月20日，蒋介石宣布全城戒严，命令解除中山舰武装，逮捕李之龙，派军队收缴工人纠察队武装，包围省港罢工委员会和苏联顾问住所，强迫在第一军工作的周恩来等共产党员退出该军。中山舰事件（也称“三·二O”事件）是蒋介石阴谋夺取国民党和国民革命军领导权的重要步骤。毛泽东、陈延年、周恩来主张以叶挺独立团为主，发动工农群众，联合国民党左派和其他各军，声讨蒋介石，逼其下台，但中共总书记陈独秀采取让步政策，结果，共产党员全部退出第一军。同时，蒋介石借中山舰事件排挤国民政府主席汪精卫，将事件诿过于汪精卫，说汪精卫挑拨国共关系，迫使汪精卫离开广州出国。4月16日，召开国民党中央党部与国民政府联席会议，改选国民党中央政治委员会和军事委员会，蒋介石出任军事委员会主席，进一步掌握了国民党军政大权。
数天后，蒋介石又提出“整理党务案”，共九条内容，规定共产党人不能再担任国民党中央党部的部长；限制共产党员加入国民党者，在国民党高级党部任执行委员时，其额权不得超过该党部执行委员总权三分之一等。此案于5月15日获得国民党二届二中全会通过。蒋介石借此改组中央党部。当上了组织部长和军人部长。国民党中央常委会委员长一职由张静江代理，中央政治会议席由谭延闓代理，张、谭二人均受蒋介石操纵，至此，蒋介石把国民党的党权也抓到手。
三
1926年初，广东革命根据地得到统一和巩固，广西李宗仁、湖南唐生智等也加入了革命阵营，武装讨伐北洋军阀的条件基本具备。同时，北洋军阀联合进攻北方冯玉祥国民军并准备南伐，国共两党及时决定出兵北伐。1926年5月，第七军钟祖培第八旅和第四军叶挺独立团分途由桂、粤入湘援助唐生智，揭开了北伐战争的序幕。
蒋介石是极力主张北伐的。其时，他已初握大权，希望通过北伐，进一步扩大自己的权势。1926年5月31日，国共合作的北伐总司令部成立。6月4日和6日，国民党中央执行委员会和国民政府先后任命蒋介石为国民革命军总司令。7月9日，蒋介石举行了总司令就职及国民革命军北伐誓师典礼。国民革命军总参谋长为李济深，总政治部主任为邓演达，前敌总指挥为唐生智，行营参谋长为白崇禧，兵站总监为俞飞鹏，军事总顾问为加伦。
国民革命军共辖八个军，第一军军长何应钦，主要将领有王柏龄、蒋伯诚、顾祝同、张贞、冯轶裴、谭曙卿、叶剑英、王俊、刘峙、钱大均等；第二军军长谭延闓（副军长鲁涤平代），主要将领有鲁涤平、岳森、张辉瓒、谭道源、戴岳、陈嘉佑等；第三军军长朱培德，主要将领有黄实、王均、朱世贵、李明扬等；第四军军长李济深（副军长陈可钰代），主要将领有陈可钰、陈铭枢、蒋光鼐、张发奎、朱晖日等；第五军军长李福林，主要将领有刘敏、练炳章、王若周等；第六军军长程潜，主要将领有唐蟒、邓彦华、杨源浚等；第七军军长李宗仁，主要将领有王应榆、钟祖怀、陶均等；第八军军长唐生智，主要将领有张一鹏、李品仙、刘兴、何健、夏斗寅、周澜等。另有航空队，由林伟成、张静愚指挥。第二、三、四、六各军党代表兼政治部主任分别由中共党员李富春、朱克靖、廖乾吾、林伯渠担任。
1926年7月，国民革命军从广州出师北伐，苏联顾问亦随军出征。北伐战争所面对的军阀势力主要有三支：一是据有河南、湖南、湖北和直隶南部的吴佩孚约二十万人；二是盘踞江苏、浙江、安徽、福建、江西五省的孙传芳约二十万人；三是据有东北和山东、直隶、热河、察哈尔等地的张作霖约三十五万人。北伐军总兵力十余万人。根据当时的军事政治形势，北伐军决定采取各个击破的作战方针，先打吴佩孚，再打孙传芳，后打张作霖。
北伐军首先进入湖南作战，7月11日便攻占长沙。8月中旬，北伐军总司令部迁往长沙。由于孙传芳采取坐山观虎斗的态度，没有积极援助吴佩孚，蒋介石于8月12日在长沙召开军事会议，白崇禧、邓演达、唐生智、李宗仁、陈可钰及军事总顾问加伦等出席。会议同意蒋介石提出的“打倒吴佩孚，联络孙传芳，暂放张作霖”的策略，决定以四、七、八军为中央军，分左、右两路首攻武汉；以二、三、六军为右翼，担任江西方面作战；以第九军（军长彭汉章）、第十军（军长王天培）为左翼，担任洞庭湖以西地区作战。
蒋介石、唐生智率中路军直趋武汉，很快突破了吴佩孚的汩罗防线，继而攻克鄂南重镇汀泗桥和贺胜桥。唐生智率第八军从嘉鱼、金口渡江绕攻汉阳；蒋介石亲率四、七军直取武昌，以期达到“先入者王之”的目的。但是武昌却久攻不下，而唐生智则早已拿下汉口、汉阳。蒋介石只好让唐生智的第八军围攻武昌，自己率部转向江西作战。唐生智于10月10日武昌首义纪念日攻下武昌，吴佩孚的主力被消灭殆尽。1927年初，广州国民政府迁往武汉。
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