黄埔军校中有一些自称是孙文主义学会人，与在上海的西山会议派有联系，主张反苏反共。他们看透了蒋介石的心思，1926年3月18日，乘一艘由上海到广州的商轮因在海上被劫、停泊黄埔港要求保护之机，由黄埔军校驻省办事处主任欧阳钟（孙文主义学会骨干、海军军官学校副校长欧阳格之侄）假称“蒋校长命令”，通知海军局代局长李之龙（共产党员）调中山舰由广州到黄埔“听候差遣”。这时蒋介石不在黄埔而在省城。之后，又因联共中央委员、红军总政治部主任布勃诺夫率领的苏联使团要参观中山舰，李之龙用电话请示蒋介石，可否调中山舰返省？蒋介石于是猜疑起来，认为自己没有调令，却调中山舰去了黄埔；而现在发现自己在省城，又把中山舰调回省城；随即惶惶然联想起孙文主义学会散布的“共产党要干（掉）他”、汪精卫要“赶走他”的传言，认定此举是要“强掳蒋介石去莫斯科受训”的“阴谋”。蒋介石起初颇为踌躇，曾想离开广州退到汕头他所掌握的东征军总指挥部，转而与身边亲信密谋后决定，就地“反击”。20日，他宣布广州紧急戒严，逮捕李之龙，监视和软禁第一军党代表周恩来等大批共产党人，解除省港罢工委员会工人纠察队武装，包围苏联领事馆和苏联顾问住宅。史称“中山舰事件”（又称三二〇事件）。[31]
事件发生当天，中共广东区委书记陈延年及毛泽东、周恩来等人，向苏联顾问团提议采取强硬方针，动员在广东的国民党中央执监委员到肇庆集中，依靠当地驻防的共产党人叶挺独立团的力量，争取对蒋介石此举极为不满的第二、三、四、五、六各军，通电反蒋，指责他违反党纪国法，必须严办，削其兵权，开除党籍。[32]周恩来也回忆：“这时，谭延闿、程潜、李济深都对蒋不满”，“各军都想同蒋介石干一下”。[33]就是说出现了“反蒋联盟”。汪精卫更是站在这个联盟的一边。21日傍晚，蒋介石以探病为名访问汪精卫，只见汪“怒气勃勃，感情冲动，不可一世”。[34]当时鲍罗廷和苏联军事顾问团团长加伦正回国述职，代理团长季山嘉支持汪精卫和共产党的反蒋计划。但是，比季地位更高的布勃诺夫根据自己的判断，获得莫斯科批准后，决定对蒋取退让方针。
事件发生后第四天即6月24日，布勃诺夫在苏联军事顾问团全体大会上做了六个小时的报告，阐明了为什么必须对蒋介石让步的理由，第一条就是“不吓跑大资产阶级”。他认为事件“是由三种矛盾造成的”：（1）集中统一的国家政权同尚未根除的中国军阀统治陋习之间的矛盾；（2）国民革命的基本力量与城市小资产阶级和工人阶级之间的矛盾（小资产阶级向买办资产阶级利益的方面摇摆）；（3）国民党左派与右派之间的矛盾。并指出右派孙文主义学会是香港“政治买办”，“代表大资产阶级利益”。面对这些矛盾，他强调：“我们无论如何不能在现在承担直接领导国民革命的这种完全力所不及的任务，也就是依靠自己的双手来直接实行基本的革命措施的任务。”他认为“三月行动无非是一次针对俄国顾问和中国政委的小规模准暴动”，“整个行动是针对俄国顾问和中国共产党人的”。为此，他批评苏联顾问包括中共在广州工作特别是军事工作中的“过火行为”，认为这些行为引起的后果是：“1.更加吓跑大资产阶级；2.引起小资产阶级的动摇；3.一再复活尚未根除的中国军阀统治陋习；4.加深和挑起国民党左派和右派之间的矛盾；5.激起在‘打倒赤祸！’口号下的反共浪潮；6.造成国民政府的危机和总起来更使国民革命有遭到失败的危险。”
可见，布勃诺夫为当时的广州描绘了一幅多么危险的图画，并认为这是引起中山舰事件的根源。但是，他所指的“过火行为”主要是指苏联军事顾问团的行为：“实际上我们给中国将领脖子上套上了五条锁链：司令部、后勤部、政治部、政委和顾问”；“在作战部队中政委有权签发每一道命令，在军事机关中政委有更大的权力，而且还有俄国顾问，他们常常不只是出主意而是发号施令”，等等。对此，他提议“司令部不是以俄国顾问为首而是中国将领。这个方针当然是对的。只能让俄国顾问真正做顾问，不要出头露面，不要发号施令，不要惹中国将领讨厌”。
具体对三二〇事件时的形势，布勃诺夫说：“在21日夜间我们接到报告说，20日行动可能继续进行，所以我们开了一个会，得出以下结论：广州市内力量对比对国民政府不利，省内力量对比对国民政府有利，需要赢得时间，而要赢得时间就要作出让步……由于作出这种让步，我们取得了某种均势。”[35]
从事件发生后一度出现“反蒋联盟”和蒋介石的冒险与心虚状况来看，布勃诺夫对形势的估计完全是主观主义的。而且，即使苏联顾问团有对“中国将领”包办太多，监督太严的错误，也不能让中共陪绑，改正顾问团的错误，而牺牲中共的利益。
蒋发动此变，本来也是在自感力量不足并无必胜把握的情势下的冒险试探，所以，20日下午，他应季山嘉要求撤去了对顾问团的包围，并表示他的行动不是针对苏联的，随后，又向国民党中央军事委员会呈书表示反省，自请处分。但是，蒋也没有想到，他的行为竟然把这位“久经锻炼的老布尔什维克”吓成这样。于是，布勃诺夫亲自出面与蒋介石谈判，蒋提出俄国顾问团包办太多等许多错误。布表示决定撤销季山嘉团长及两个副团长的职务并令其回国。汪精卫失望之极，先是隐匿不出，继之出走他国。所谓“反蒋联盟”立即瓦解。李之龙被查办，第一军和黄埔军校中的共产党人全部被清除。蒋介石的试探性进攻得到了全面的胜利。
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