巴斯德反对自然发生的说法。他认为，微生物也有它们自己的父母，不 可能无中生有，自己长出来。要反驳艾尔蒙说的变小老鼠的戏法，还是比较 容易的，你只要眼睁睁地守着那破布和牛奶酪，它就怎么也变不出小老鼠来。 可是，要反驳那种认为甜菜汁中的酵母菌是自己长出来的，却并不那么容易。 因为酵母菌这种小东西，用眼睛根本看不见。要反驳“自然发生说”的确得 动一番脑筋。
围绕自然发生说，意大利牧师斯巴兰扎尼和英国的尼达姆之间发生了论 战。尼达姆认为，经过煮沸然后密封在煮沸容器里的肉汤，可以自然地产生 微生物。而斯巴兰扎尼反对这一观点。他把肉汤在预先密封的容器煮沸，并 延长了加热时间。实验证明只要加热的温度在水的沸点以上，防止加热后外 界空气的进入，肉汤就能长久地保存，而不产生微生物。
1858年12月，法国科学院院士、里昂博物馆馆长普歇正式向法国科学 院提出一篇《人造空气和空气中自然发生的植物和动物原生体小论》的论文， 断言“生物自然发生是可能的”。他认为放在空气中的动物和植物，自己能 长出微生物。
巴斯德不同意普歇的观点，认为这些微生物不是自己长出来的，而是从 空气中进去后，在那里繁殖起来的。巴斯德没有公开反驳普歇，因为那时他 手里的证据不足，他要用实验来证实自己的见解。
恩师毕奥知道了巴斯德的想法，就想劝阻他。毕奥说：“巴斯德先生， 生物是否自然地发生，是个不可能解决的问题，你为什么想要研究这样的问 题呢？”巴斯德回答道：“因为这个问题和我至今仍在研究的发酵问题有密 切的关系。引起发酵的是叫酵母菌的微生物，我很想知道它是从那里来的。 如能彻底解决自然发生说这一问题，那么，我的发酵方面的研究就可以顺利 进行，所以，这个研究对我是绝对必要的。”恩师担心巴斯德一旦研究下去 就脱不得身，而且说不定不会有什么确实的证据，还会影响他的其他研究工 作，但固执的巴斯德还是执意回答：“总得试一试看。”
巴斯德的另一位恩师塞纳蒙听说了这件事，他深信巴斯德的才能，说道：
“巴斯德向来都耐心研究一些看来没法解决的问题，结果都解决了。说不定 这一问题也能被他解决，何不让他去试一试呢？”
巴斯德又开始了新的研究。这时他的研究室从小阁楼转移到校门口守卫 室旁边的小建筑物里面，虽然仍很简陋，但比小阁楼宽大了。巴斯德有了一 名年轻的助手名叫裘尔·罗兰。他是高等师范的毕业生，是第一个进入巴斯 德研究室当助手的人。
开始研究的时候，巴斯德使吸入到容器里的空气先经过塞有棉花的管 子，空气中的固体微粒便被棉花吸附，棉花变为黑色。结果，溶液腐败了， 长出了微生物。巴斯德将带有固体微粒的黑色棉花浸泡在易腐溶液——肉汤 中，观察其是否有微生物生长。巴斯德在另一个瓶子里也装入肉汤，他把肉 汤煮沸，然后把瓶口的玻璃烧红后，把瓶口封死。这种肉汤不论放置多久， 总也不会腐败，长不出微生物来。
经过一年的研究，巴斯德终于得出如下的结论：空气中飘浮的东西，除 了微生物的胞子，都不具有形成生命的条件。
普歇反对巴斯德的这一结论，他认为，微生物是肉汤自己长出来的；生 物的生长需要自然的空气，至于煮沸肉瓶中的空气是经过加热的，而微生物 的生长需要自然的空气。
巴斯德为了证明生物是不能自然发生的，接受了化学家兼药剂师巴拉的 建议，改进了试验的方法。巴斯德特地设计了一种玻璃烧瓶，即“天鹅颈瓶”。 巴斯德将肉汤倒入球形瓶中，将球形瓶置于高热火焰中加热煮沸。瓶颈用火 焰加热后，拉成天鹅吃食样的小管，管口向下开着，不封死，瓶内的肉汤放 很长的时间也不会长微生物。原来肉汤在煮沸，空气膨胀，把瓶颈中的空气 排出去了，等冷却后，空气虽然又会回到瓶中去，可是因为空气中的微生物 是有重量的，（因为它们依附于尘埃之上）它就落在曲颈上，微生物没有腿， 所以跑不到瓶里去，瓶中的肉汤便没有微生物生长。但若将同样处理的烧瓶 摇动，使肉汤溅到弯曲细长的管壁，再流回烧瓶，培养后的肉汤就变得混浊， 证明了有微生物生长，它们是由于尘埃带入的。
普歇仍然不服，他认为巴斯德说的空气中附着于尘埃之上的微生物根本 不存在。巴斯德认为普歇的反驳是有道理的，怎样证明反流入瓶中的空气中 一定有微生物呢？巴斯德决定继续实验。
1860年9月10日，巴斯德做了几百个圆肚烧瓶，瓶中不用烧沸的肉汤， 只用消过毒的肉汤。巴斯德将烧瓶放在水中煮沸几分钟，把瓶中的空气赶出 去。同时用火焰烧熔瓶颈，拉成细长的小管并封住管口。如果折断小管，外 界的空气就会带着尘埃进入瓶内，再把管口封住，放在温箱中培养。
巴斯德想，如果真是空气中会自然发生微生物的话，那么，不论什么地 方的空气都应该是一样的。巴斯德把许多瓶肉汤分别放在空气很少流动的巴 黎天文台地下室和空气流动的院子里，小心地把瓶子的颈口夹破，让空气进 入瓶内，然后再用火封死。培养的结果表明：在地下室收集的10瓶，除一瓶 稍有混浊外，全都透亮澄清，没有微生物生长；在院子里收集的11瓶，都变 得混浊，都有微生物生长。
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