巴斯德这样不厌其烦地试验呀，试验，他做了一百多次试验。最后，酵 母液发浑了，变成了灰色，他高兴极了。这说明：酵母是活的，它们在活动 呢，巴斯德小心翼翼地取出一滴发浑的酵母液，放在显微镜下面一看，显微 镜底下，那些小小的长圆形的小东西都能活动，它们是活的小生物。
巴斯德把从工厂里取回的变酸和未变酸的样品，分别放在显微镜下检 查。他发现在没有酸的样品中，可以看到成簇的酵母菌，它们是小圆球形的。 在变酸的样品中，看到的却是小得多的长圆条形的小生物。它们呈单独或不 规则排列的群体。巴斯德把这种拉长了的球状物叫做乳酸酵母，也叫做酵素。 现在我们知道这种拉长了的球状物叫做乳酸链球菌。
巴斯德告诉比尔，正常的酒精中只有小圆球形的小生物；而在变酸的酒 精中，却有比小圆球小得多的长条形的小生物。他要比尔在甜菜中加那种大 一些的、圆形的发酵小生物。要是在甜菜汁中发现了那种小一些的长条形的 小生物，就不要了，趁早倒掉。不要再花气力去干那些没有收获的事。巴斯 德以这种简单的观察法来判断发酵进行的好或不好，使酒精酿造失败的次数 大为减少。
巴斯德的发现，促进了法国发酵工业的发展。
巴斯德把酵母菌接种到含有酵母浸出物和糖液的试管里，培养后产生典 型的酒精发酵。把变酸样品的沉淀物接种到含有酵母浸出物、糖液和碳酸钙 的试管里，培养后产生的产品不是酒精，而是乳酸。
巴斯德把两种发酵与两种形态上不同的生物联系了起来，提出了全新的 发酵理论，认为发酵的真正原因是微生物。这一观点他是在1857年的《关于 乳酸的记录》一文中提出的。在这篇论文里。他用改变添加到培养基中碳酸 钙量的方法，第一次证明了PH对微生物代谢的影响。这篇论文被公认为是经 典著作，它不仅使人们知道了发酵的本质，还建立了导致传染病里由特定病 因引起的概念。同时巴斯德在论文中提出了配制培养基的基本原理，即碳源、 氮源、盐类、维生素和PH等。这篇论文为现代微生物学和微生物化学奠定了 基础，使微生物学由推测、观察时期，发展到培养时期。
1857年，巴斯德调往巴黎的母校——高等师范学校，担任行政副校长兼 理科主任，继续从事酒精发酵的研究。找不到适合做研究室的房子，他就把 一间学校弃置的阁楼改造成研究室。巴斯德在洞穴般的研究室里进行研究工 作。
在培养酵母的实验中，有一次，巴斯德在培养基中偶然没有加入酵母浸 出物，却加了酒石酸铵。接种酵母菌后，酵母菌生长繁殖了。
巴斯德对发酵液中的酒石酸铵进行测定，发现铵盐减少了，也就是被酵 母菌利用了。
经过进一步的试验证明，酵母菌在没有糖和氮源的条件下能生长；在只 有糖的培养基中，酵母可以发酵，但不能繁殖；在加有糖和氮源 （酵母浸出 物或铵盐）的培养基中，酵母菌可以发酵，也能够进行繁殖。
巴斯德在这年12月向法国科学院提出了论述酒精发酵的论文。巴斯德的 结论是：没有活的酵母菌参与，糖绝不会进行酒精发酵。这说明了有生命的 酵母菌和糖发酵的酒精之间的因果关系。
在这以后，巴斯德研究了氧气对酵母菌生长和酒精发酵的影响。在有氧 时，酵母菌生长旺盛。产生1份酵母菌体要消耗8—10份的糖。在无氧时， 酵母繁殖菌体的量变少，产生1份酵母菌体要消耗60—80份的糖，同时产生 大量的酒精。这一工作开创了用定量方法研究微生物代谢的先例。酵母菌发 酵糖除产生酒精和二氧化碳外，巴斯德还测出产有甘油、琥珀酸及测定不出 来的其他产物。
由于巴斯德研究酒精发酵和乳酸发酵作出了杰出的贡献，法国科学院于 1860年1月30日授予他实验生理学奖。
从1861年起巴斯德开始研究醋酸发酵和制酸了。他发表了许多将理论和 工业生产相联系的论文。当时人们对醋酸发酵已有了深入研究，了解了酒精 经氧化生成醋酸的化学过程。这一概念与德国制醋的方法相同。巴斯德研究 醋酸发酵后发现，微生物对发酵是重要的，酒转变为醋是由醋酸醭酵母 （醋 酸菌）完成的。醋酸菌在发酵液表面形成菌膜，有时是平滑的，有时是有皱 纹的，摸上去有油腻的感觉。醋酸菌的生长需要空气，不然就会死去，它从 空气中吸取氧，把酒精氧化为醋酸。在发酵过程中，醋酸菌占优势，醋化便 可成功。如果染有杂菌，醋化就会失败，在醋化完成之后，如果醋酸菌继续 进行氧化，醋酸便进一步氧化为二氧化碳和水。这就给制醋业带来危害。
为了防止杂菌污染和醋酸菌的进一步氧化，巴斯德提出接种醋酸菌，发 酵完成之后，用55℃加热的方法抑制醋酸菌和杂菌的活动和生长。用这种方 法制醋，可提高产量3—5倍，并大大减少了醋酸的挥发。
四、生物是自然发生的吗？
巴斯德的研究证明，甜菜汁变成酒精是酵母菌活动的结果，它变成酸是 乳酸链球菌活动引起。可是，酵母菌和乳酸链球菌是怎样来的呢？巴斯德久 久地思索着。为了继续探讨这一问题，他又着手进行生物自然发生说的研究。
生物自然发生说早在希腊时代就有了。这种理论认为生物只能通过自然 发生才能产生，时时处处都在进行。16世纪开始有人认为生物只能由生物而 来，这种观点一度居于优势。17世纪末发明了显微镜并发现了微生物，信仰 自然发生说的人们把这一问题重新提了出来。在雨水中和暴露于空气中有机 物的浸出液里，都能观察到极小的生物。对这一观象，部分科学家认为只能 用自然发生说来解释。著名医生艾尔蒙甚至说：“把一些破烂的碎布和一块 干牛奶酪放在一起，不消多久，就能变成一只小老鼠。”
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