首先，孟德尔必须确立豌豆的可明显区分的相对性状，并从众多的豌豆 中培育出这种具有相对稳定性的品种才能确保实验的可靠性。他陆续从商人 处购买了34个豌豆品种，经过2年试种，从中挑选出具有性状相对稳定的 22个品种，为他的杂交实验提供可靠的基础。
实验的第二阶段，孟德尔又精心选择了可供实验的7组具有明显可区分 相对性状的豌豆植株，作为杂交材料。这7组是：
子叶颜色 黄色 绿色
开花位置 腋部 顶端
茎的高度 高茎 矮茎
豆荚形状 饱满 缢缩
种皮颜色 灰色 白色
种粒形状 圆形 皱形
未熟豆荚颜色 绿色 黄色
现在我们知道，孟德尔确立的这7种性状恰巧分别位于豌豆的七对染色 体上，这固然属于偶然，但也充分说明了孟德尔观察的敏锐性。植株性状的 确定，为孟德尔观察它们的遗传提供了条件。他将具有一对可区分性状的植 株作为一组进行杂交，如高茎×矮茎、种粒圆形×种粒皱形等等。单独观察 它们的遗传，而不是像他的前辈们那样笼统地观察植株全部性状的传递。
这样一来孟德尔就观察到：在所有7组实验中，杂种性状都类似于两个 亲本中的一个，不表现为融合的中间形态。如圆形种粒同皱形种粒品种杂交， 产生的杂种全为圆形种粒；红花植株与白花植株杂交，产生的杂种则全为红 花植株。杂种 （子一代）之间产生的后代（子二代）则发生性状分离现象： 两个亲本类型的性状同时表现出来，同样没有融合的中间状态。例如杂交后 得出的红花植株相交后，红花、白花都出现了。孟德尔把在子一代中表现出 来的性状叫作“显性”，把子一代中不表现而在子二代中表现的性状叫作“隐 性”。这样，像前辈们一样，孟德尔也观察到了杂种的显性现象 （孟德尔称 之为“同一性”）和杂种后代性状的分离现象。但他没有停留在这一步。他 进而分析了杂种后代性状的分离比率。例如在上述的杂交中，圆形种粒是 5474颗，皱形种粒是1850颗，两者之比为2.96∶1，在929棵子二代豌豆植 株中705棵为红花，224棵为白花，显性性状与隐性性状的个体比为3.05∶1。 其他的几对实验结果也很相似，显性性状与隐性性状之比都接近3∶1这个比 率。
孟德尔很清楚，这个3∶1绝非是偶然的数字游戏，它反映了植物性状遗 传的数量统计规律性，但是如何解释它呢？
当时，“融合遗传论”盛行，即认为对性状遗传起作用的是双亲的血液， 子代所表现出来的性状是由父母融合或混合而成，子代的性状是双亲性状的 折衷。按照这种理论，双亲的不同特性在融合中会各自消失一部分，经数代 之后，某些双亲的性状就会逐渐消失。孟德尔从杂交实验中否定了这种理论。 他认为翁格尔老师的颗粒遗传因子理论似乎更加正确些，它们在遗传过程中 独立存在，互不融合可能更能说明遗传的事实。他也记起了多普勒老师以果 推因的假说演绎法。他根据豌豆子一代完全出现的显性性状和子二代出现 3∶1，的分离性状和颗粒遗传因子的可能存在，以及数理统计规律，大胆地 提出了自己的假说，即每一植株中，每一相对性状是各由两个相同的因子或 颗粒决定的显性为CC，隐性为cc，在细胞中成对存在的特征，一来自父本， 一来自母本，在形成配子时，成对的遗传分子彼此分离，分配到不同的配子 中去，每个配子只有成对遗传因子中的一个。杂种一代的体细胞中的遗传因 子则形成杂合子 （Cc），遗传因子则有显性、隐性之分，但它们独立存在， 互不干涉，表现出显性因子控制的性状。到杂种子二代，则由于隐性、显性 因子相互分离，由于不同的组合，出现了显性及隐性性状，其分离比为3∶1。
孟德尔提出的假说与7种相对性状杂交实验的结果完全符合。但孟德尔 并未就此止步。他是受过严格训练的科学家，假说只能解释实验事实，但不 是最可靠的。这个假说如果正确，还必须以此作为普遍原理演绎出可实验的 其他事实，并获得实验的证实，才能使这个假说更加有效。他又设计了豌豆 的“回交”实验，进一步验证遗传因子在形成配子时彼此分离。回交实验的 特点是利用杂种子一代与亲本之一进行交配，这个亲本既可以是隐性，也可 是显性，但为了严格检测出遗传因子是否分离，用隐性亲本与之交配更能说 明问题，这种限以隐性亲本作交配的杂交实验又称“测交”。孟德尔利用回 交中的测交实验，进一步验证了遗传因子在杂交过程中也是分离的。其预计 结果子二代的红花与白花比为1∶1，实验结果证明了预计结果。
这样，孟德尔发现了一条重要的遗传学规律：当具有成对不同性状的植 物杂交时，所生第一代杂种的性状都只与两个亲本中的一个相同，另一亲本 的性状在杂种第一代隐而不显。而将杂种第一代再自相交配（白花授粉）时， 所生后代 （子二代）的性状就不再相同，而会发生分离，并且显性性状个体 数与隐性性状个体数间呈一恒定比数——3∶1。这条规律，后来被人们称为
“孟德尔第一定律”或“分离定律”。
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