2月26日，蒋介石突然扣留了王懋功，给了他3000元路费和一张船票，限令他立即离开广州。随后，蒋介石任命自己的亲信刘峙代理第二师师长，缪斌为党代表。"这是蒋介石为中山舰事件作的准备"。蒋介石这样做，还有一个原因，就是想试探一下汪精卫和苏联顾问的反应。这一点，蒋介石显然成功了。他削弱了汪精卫的势力。
蒋介石向汪精卫作出第一次示威之后，又致电周恩来，催促他速回广州。周恩来发现蒋介石同右派来往密切，并且觉察到"他的神色不对"，便报告了张太雷。可惜，"苏联顾问不重视这事，把一个大问题当作小问题，儿戏对之。"
在中山舰事件中兴风作浪的是孙文主义学会，这是黄埔军校反对国共合作的右派团体。黄埔军校创办之初，国民党右派谢持从上海跑到广州，名义上是参加学校开学典礼，实际上却在拉拢学校里的右翼分子，如王柏龄、贺衷寒、潘佑强、冷欣。他甚至散布谣言说：共产党名义与国民党合作，"其实是想乘机篡夺国民党的党权，一朝得逞，所有国民党员，尤其是黄埔同学中的国民党员，将受到无情的迫害，而无立足的余地。"这番话激起黄埔军校右派分子对共产党学员的仇视。而青年军人联合会里的共产党员又在军校公开散发《响导》周刊和其他宣传共产主义的刊物。于是，黄埔军校里的右派分子由此断定青年军人联合会并不是一个青年军人的联合，而是"作为发展共产党组织的据点"，便决定"采取以组织对付组织的行动"。孙文主义学会就是在这样一种形势下，专门为对抗青年军人联合会而成立的，"并不是为了要学什么孙文主义"。学会在成立之初，就同西山会议派有瓜葛，并且受戴季陶的直接领导。结果，这个学会一经组织起来，"就千方百计地找共产党员同学惹事生非，寻衅肇祸，种种蛮不讲理的情形，真是举不胜举。"后来参与中山舰事件的骨干分子欧阳格、除策、缪斌、吴铁城都是孙文主义学会的成员。
孙文主义学会的阴谋策划，直接导致了中山舰事件的发生。他们曾警告蒋介石，对俄国人的迁就只能以一个共产主义的中国而告结束，左派力量正在成为主要威胁，对其采取行动的时机已经到来。据包惠僧反应，这一事件"完全是王柏龄、欧阳格、徐桴、吴铁城等阴谋制造出来的。"可以肯定，中山舰事件就是"蒋介石与孙文主义学会、国民党右派经过多次讨论，有计划有准备去进行的。"所以，当中山舰开到黄埔之后，孙文主义学会立即散布谣言，说共产党要举行暴动，推翻国民政府，逮捕蒋介石。
本来，在事件发生前夕，蒋介石就收到一封署名李之龙的来信，建议蒋介石在三天之内通过国民政府把广东企业收归国有，并且威胁说，如果蒋介石拒绝，就逮捕他，把他送到俄国去。
这封信显然是伪造的，但孙文主义学会借题发挥，向蒋介石解释说，派中山舰和写信本身就说明，"俄国共产党人和中国共产党人要把蒋介石驱逐出广东"。
曾在广州担任季山嘉翻译的维什尼亚科娃-阿基莫娃回忆说，这个学会和戴季陶在中山舰事件中的作用是无可置疑的，她常听人说，1925年秋，蒋介石就已受到这个学会的有力怂恿，"3月20日他仅仅是执行者，为他出谋划策的是戴季陶。有人把蒋介石比作武装的戴季陶。"
关于孙文主义学会在中山舰事件中所起的作用，王柏龄直言不讳地说过："其收功之总枢，我敢说，是孙文主义学会。若没有学会的话，党老早就没有办法了。学会能立了这点功，也不枉这些对党热心效忠的同志"。
3月20日凌晨，蒋介石下令广州戒严，命令陈肇英、王柏龄逮捕了李之龙，让刘峙扣押了第二师各级党代表，还派军队包围了省港工人罢工委员会，收缴了纠察队的武装，该师第五团占领了海军局，并解除了海军局的武器。陈策、欧阳格率部劫持了中山舰，解除了军舰上的武装。
上午9时，第二师第五团的一个连包围了坐落在东山的苏联顾问团住地和办公室。一时间，东山岗哨林立，如临大敌。不准苏联顾问外出，不准到办公室去，甚至不准上医院，还剪断了电话线，解除了卫兵的武装，甚至扬言要把顾问们驱逐出广东。
当时，苏联顾问也考虑过进行抵抗，无赖他们在广州的人数只有40多人，力量单薄。直到下午2时，包围东山的部队才撤走，并发还了军械。
布勃诺夫使团亲眼目睹了中山舰事件的发生，他们"实际上遭到暂时的拘禁"。事件发生之后，布勃诺夫断定，这是一次"针对俄国顾问和中国共产党代表的小型的半暴动"。
张国焘也是这么认为的，他在回忆录中写道：这一事变包含着反抗苏俄控制的民族观念，要对中共加以压抑的反共意识。领导这一事变的蒋介石所采取的手段，却是一种推翻原有领导的军事异动。
经过中山舰事件，250多名已经暴露身份的共产党员撤出了第一军和黄埔军校，蒋介石牢牢控制了第一军。他向这些共产党员作了解释，但把自己的责任推脱得一干二净。他说，为什么要各位都退出来呢？因为当时确实有人对各军军长说：共产分子在第一军内虽然不多，但是这些分子一个可以当十个用，并且是有团结的，可以随时制服其他一切。有人在演讲中说："中国革命没有成功，就要杀共产党吗？"这些话引起一般军官的恐惧与自卫，所以，对党代表感到不安和怀疑，这些军官要求共产分子全部退出来。
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