蒋介石坚决拒绝，说战时总司令必须独断，这是自己的责任。并说他愿意辞掉总司令职务，“如果我愿意做总司令，那末我就不是蒋中正。”
1927年1月日，蒋亲自到武昌参加联席会议。在会议期间，他和鲍罗廷开始了公开的斗争。他指责鲍罗廷破坏了孙中山的三大政策。鲍罗廷则警告蒋介石，谁镇压农、工运动，反对共产党，我们无论如何，也要打倒他的。蒋则反驳鲍氏，说他的话没有任何根据，又说苏联已不是三年前的苏联，已被世界上认为是赤色帝国主义者了。并且现在不是我们放弃孙总理的联俄政策，而是你来阻挠我们执行总理的联俄政策。（蒋介白：《庆祝国民政府奠都南京欢宴席上致词》，1927年4月18日。）
其实蒋反苏反共之心早已有之，决不是由于鲍氏的“破坏”。从此以后，蒋和鲍罗延就公开决裂了。1月27日，蒋就公开提出驱逐鲍罗廷，强调以独立自主为原则，主张不受外界任何影响。当然，武汉政府决不会理会蒋介石的唠叨。于是南昌和武汉间的斗争，进一步激烈和公开化。
宁汉对立
蒋介石一面和武汉中央进行不妥协的暗中斗争，一面继续制定北伐计划。新的北伐计划于1927年1月6日制定完成，主要任务是底定苏浙，占领上海。
主要分三路进军：
东路军：由何应钦任总指挥，白崇禧任前敌总指挥，自福建指向杭州、上海。
中路军：由蒋本人任总指挥，辖程潜江右军（南岸）和李宗仁江左军（北岸）。江右军向皖南挺进，策应何应钦东路军作战。江左军则牵制安庆之敌，指挥新起义的皖省军队，相机向攻取寿州、合肥，使敌不敢向江南增援。
西路军：唐生智任总指挥，俟机由武胜关进取河南，主力控制京汉线南段。东向策应皖省作战，挺进豫东；西上监视鄂西残敌（于学忠等直系残部）于襄樊。
总预备队，由朱培德任总司令。
1月26日，东路军开始进军，2月18日，收复杭州。然后白北指上海；何西向镇江。
此时，张学良到徐州支援孙传芳；张宗昌也到了南京，并于2月27日接防上海。
2月下旬，蒋介石中路军相应东进。李宗仁江左军由于陈调元等纷纷起义，兵不血刃，进驻合肥，底定皖省，使上海北军归路西侧受到威胁。张宗昌上海守军毕庶澄，遂弃守北逃。周恩来于3月21日领导上海起义，组织上海市特别委员会，占领上海警察局。白崇禧于同日进驻上海。3月22日，何应钦占领镇江。
程潜第六军于3月23日占领南京，孙传芳残部逃走。
江、浙、皖、赣、闽、湘、鄂、两广、贵州，被国民革命军攻占。
武汉中央于1至2月间正在考虑罢免蒋介石总司令之职，拟由李宗仁出任总司令，由鲍罗廷出面和李谈。鲍对李说，不能再让蒋任总司令了，否则他要成为大独裁者，革命势必前功尽弃。我看李将军最堪接替蒋职。
李宗仁敦厚有余，一听此言，非常惶恐，便正色辞谢不敢，并一连说本人为国为民，不敢争位。同时他也由于暗中对苏联、中共不满，认为他一出任，国民党必然分裂，无人能领导中央党、政。如此以来，则国民党便不是中共对手，会土崩瓦解。因此，他决心不干总司令，以求国民党之团结一致。
程潜第六军和第二军（鲁涤平代）于3月24日在南京举行入城式后，有些士兵出手民族义愤，攻击美、英、日等国领事馆。下午3时，美、英两国炮舰就突然向南京军民开炮，炸死平民十五人，重伤九人；军人官兵被炸死二十四人，炸伤七人，造成有名的南京惨案。而美国死一人；英国死三人；法国、意大利各死一传教士，和中国死伤人数相差悬殊。
蒋介石于3月31日在南京总部招待日、美、英、法等国报社记者，发表专门谈话，说明总部负责调查，如果确系革命军所为，“当有相应办法”，“但英美军舰开炮前，并无提出任何警告，当向南京外人当局提出抗议，要求赔偿损失”。但措词很不强硬。他第一次和帝国主义者交锋，就显得软弱无力。
这次日本人特别表示了沉静和克制，未随英、美开炮，其根本原因是为了使蒋介石的北伐进入有利于日本利益的轨道，怕蒋不执行密约，以至于无决心和苏联脱离关系。同时也怕未及收容好的日侨，因开炮而被害。因为日侨比英、美在南京的侨民要多得多。
蒋介石既已和武汉中央公开表示对立，又和鲍罗廷吵了一架，加之他早已在南昌为和苏联、中共分道扬镳而积极准备，便决心迅速脱下伪装，另立国民党中央和另建国民政府。
蒋于3月26日到上海，决心“清党”。但他对报界发表谈话时仍否认他与武汉中央的强烈冲突，并说各领袖间仍和衷共济，无大不合处，国民党也不会分裂。3月28日李宗仁到上海，先见到白崇禧。这时白的总部已被工人群众包围，白很沮丧，表示要抑制上海工人运动。随后李又见蒋介石。蒋也面色沮丧，并且声音已经嘶哑。还口口声声说：“我不干了，我不干了！”李问其原因，他说何应钦要辞职，而且他已无法掌握第一军了。这是因为黄埔学生对他反对武汉中央，反对鲍罗廷，又要“清党”的突然的反向转变，不知所措，纷纷质问他。他也不得不百般辩解，以至声音嘶哑。而且第一军第一师长薛岳和第二十一师师长严重，均有左倾迹象；刘峙第二师内，也军心不稳。总之是军心混乱。这是因为蒋以前的左倾讲话对学生们，对军队的印象太深了。
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